Mathieu Amalric est né le 25 octobre 1965 à Neuilly-sur-Seine. Après s'être essayé aux classes préparatoires littéraires, il rate en 1985 le concours de l'Idhec, mais s'investit dans la réalisation de courts-métrages, puis travaille sur différents tournages comme accessoiriste, cantinier, ou régisseur, ainsi que dans la société de production de Paulo Branco. En 1987, il est stagiaire à la mise en scène sur Au revoir les enfants de Louis Malle.
En 1991, Mathieu Amalric fait la connaissance d'Arnaud Desplechin au Festival Premiers Plans d'Angers, alors qu'il présente son court-métrage Sans rires et Desplechin son long-métrage La Vie des morts (Prix Jean Vigo). Il déclarera de multiples fois que c'est Desplechin, grâce à ce film, qui « l'a inventé comme acteur ». Comédien éclectique dans ses choix, allant du cinéma d'auteur français aux grosses productions américaines, il reçoit en 2005, le César du meilleur acteur pour Rois et Reine du même Arnaud Desplechin. Devenu « acteur par accident », Mathieu Amalric se considère principalement comme un réalisateur de cinéma.
Ses premiers courts métrages sont réalisés de manière quasi-artisanale dans les années 1980, puis avec l'aide notamment du Groupe de recherches et d'essais cinématographiques (GREC) en 1990 pour Sans rires. Cette première œuvre notable est présentée quelques mois plus tard au 9e festival « Tous courts » d’Aix-en-Provence où il obtient le Grand Prix du jury, ce qui constitue son tout premier prix cinématographique.
En 2004 il est membre du jury du 26e Festival international du court métrage de Clermont-Ferrand. À la surprise générale, il annonce, en tant que porte-parole, la décision unanime ne pas remettre le Grand prix de la Compétition française (le prix le plus important pour les films français dans ce festival), notamment à cause du « manque d'inventivité formelle » des films présentés et du danger « d'uniformisation de la culture ». Dans un entretien au journal L'Humanité, il s'en explique, reprochant aux films sélectionnés d'avoir cherché à
« simplifier le monde, au lieu de puiser, de chercher, de s'interroger sur la complexité de l'être humain, d'être sans inventivité ou fantaisie, et de se contenter de filmer leur
scénario ». Précisant sa vision de réalisateur, il considère alors qu'un film ne doit pas avoir de « fonction sociale » ou délivrer de message — sans intentions et « surtout pas de bonnes intentions » —, un artiste devant principalement filmer pour le seul désir de filmer. À partir de 2010, Mathieu Amalric décide de moins jouer en tant qu'acteur afin de mener à bien ses projets de metteur en scène. Il réalise alors son quatrième long métrage, Tournée pour lequel il remporte le Prix de la mise en scène lors du Festival de Cannes.